主要是对前面的文章，“Samtools命令详解”博文的一个补充，整理，更全面，有一些新版本的东西！其实把前面全包含进来了。
一、 SAMtools和BCFtools简介
SAMtools是一个用于操作sam和bam文件的工具合集，包含有许多命令。
BCFtools主要是用来操作vcf和BCF文件的工具合集，包含有许多命令。
二、 SAMtools和BCFtools的安装
2.1 对于老版本
在0.1.19这个版本及以前版本中samtools和bcftools是整合到一起的，下载链接：https://github.com/samtools/samtools/archive/0.1.19.tar.gz
在下载之后解压，直接make，然后将Samtools和bcftools直接添加到环境变量中就可以使用；1
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7$ wget https://github.com/samtools/samtools/archive/0.1.19.tar.gz
$ tar zxf samtools-0.1.19.tar.gz
$ cd samtools-0.1.19
$ make
$ echo 'PATH=$PATH:/your/samtools/path' >> ~/.bashrc
$ echo 'PATH=$PATH:/your/bcftools/path' >> ~/.bashrc
$ source ~/.bashrc
2.2 对于新版本
对于最新版本的下载：www.htslib.org，SAMtools 新的 1.0 版本改进比较大。 SAMtools 包含 3 部分：1
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3Samtools : 对 SAM/BAM/CRAM 格式文件进行读、写、索引和查看操作。
BCFtools : 对 BCF2/VCF/gVCF 格式文件进行读写操作； 对 SNP 和 short indel 进行 calling/filtering/summarising
HTSlib : 用于高通量数据读写操作的 C library
老版本(0.1.19)的概要：1
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13samtools view -bt ref_list.txt -o aln.bam aln.sam.gz
samtools sort aln.bam aln.sorted
samtools index aln.sorted.bam
samtools idxstats aln.sorted.bam
samtools view aln.sorted.bam chr2:20,100,000-20,200,000
samtools merge out.bam in1.bam in2.bam in3.bam
samtools faidx ref.fasta
samtools pileup -vcf ref.fasta aln.sorted.bam
samtools mpileup -C50 -gf ref.fasta -r chr3:1,000-2,000 in1.bam in2.bam
samtools tview aln.sorted.bam ref.fasta
bcftools index in.bcf
bcftools view in.bcf chr2:100-200 > out.vcf
bcftools view -Nvm0.99 in.bcf > out.vcf 2> out.afs
新版的 SAMtools 将 SAMtools 和 BCFtool 分离开，成为 2 个独立的软件包。 这 2 个都运用了 HTSlib，并且其软件包中都包含了 HTSlib 。
最新版的BCFtools和SAMtools也可以通过Github下载：1
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7$ git clone --branch=develop git://github.com/samtools/htslib.git
$ git clone --branch=develop
$ git://github.com/samtools/bcftools.git
$ git clone --branch=develop
$ git://github.com/samtools/samtools.git
$ cd bcftools && make
$ cd ../samtools && make
当然你也可以把它安装到自己想安装的目录下,即在上面两次make的时候，使用一下命令：1
$ make prefix=/path/to/dir install
最后再将你你的路径添加到环境变量中：1
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3$ echo 'PATH=$PATH:/your/samtools/bin/path' >> ~/.bashrc
$ echo 'PATH=$PATH:/your/bcftools/bin/path' >> ~/.bashrc
$ source ~/.bashrc
新版本(1.3.1)的概要：1
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23samtools view -bt ref_list.txt -o aln.bam aln.sam.gz
samtools sort -T /tmp/aln.sorted -o aln.sorted.bam aln.bam
samtools index aln.sorted.bam
samtools idxstats aln.sorted.bam
samtools flagstat aln.sorted.bam
samtools stats aln.sorted.bam
samtools bedcov aln.sorted.bam
samtools depth aln.sorted.bam
samtools view aln.sorted.bam chr2:20,100,000-20,200,000
samtools merge out.bam in1.bam in2.bam in3.bam
samtools faidx ref.fasta
samtools tview aln.sorted.bam ref.fasta
samtools split merged.bam
samtools quickcheck in1.bam in2.cram
samtools dict -a GRCh38 -s "Homo sapiens" ref.fasta
samtools fixmate in.namesorted.sam out.bam
samtools mpileup -C50 -gf ref.fasta -r chr3:1,000-2,000 in1.bam in2.bam
samtools flags PAIRED,UNMAP,MUNMAP
samtools fastq input.bam > output.fastq
samtools fasta input.bam > output.fasta
samtools addreplacerg -r 'ID:fish' -r 'LB:1334' -r 'SM:alpha' -o output.bam input.bam
samtools collate aln.sorted.bam aln.name_collated.bam
samtools depad input.bam
三、 SAMtools参数详解
以下主要是针对samtools-0.1.19的说明文档：http://www.htslib.org/doc/samtools-0.1.19.html
对于最新版的Samtools， 指1.0之后，有大的改动，可能一下命令介绍有些不适用新版本，所以新版参考：
SAMtools：http://www.htslib.org/doc/samtools.html
BCFtools：http://www.htslib.org/doc/bcftools.html
3.1 view
view命令的主要功能是：将sam文件转换成bam文件；然后对bam文件进行各种操作，比如数据的排序(不属于本命令的功能)和提取(这些操作是对bam文件进行的，因而当输入为sam文件的时候，不能进行该操作)；最后将排序或提取得到的数据输出为bam或sam（默认的）格式。
bam文件优点：bam文件为二进制文件，占用的磁盘空间比sam文本文件小；利用bam二进制文件的运算速度快。
view命令中，对sam文件头部的输入(-t或-T）和输出(-h)是单独的一些参数来控制的
1 | Usage: samtools view [options] <in.bam>|<in.sam> [region1 [...]] |
例子：
1 | 将sam文件转换成bam文件 |
3.2 sort
sort对bam文件进行排序1
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3Usage: samtools sort [-n] [-m <maxMem>] <in.bam> <out.prefix>
-m 参数默认下是 500,000,000 即500M（不支持K，M，G等缩写）。对于处理大数据时，如果内存够用，则设置大点的值，以节约时间。
-n 设定排序方式按short reads的ID排序。默认下是按序列在fasta文件中的顺序（即header）和序列从左往右的位点排序。
3.3 merge
将2个或2个以上的已经sort了的bam文件融合成一个bam文件。融合后的文件不需要则是已经sort过了的。1
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13Usage: samtools merge [-nr] [-h inh.sam] <out.bam> <in1.bam> <in2.bam>[...]
Options: -n sort by read names
-r attach RG tag (inferred from file names)
-u uncompressed BAM output
-f overwrite the output BAM if exist
-1 compress level 1
-R STR merge file in the specified region STR [all]
-h FILE copy the header in FILE to <out.bam> [in1.bam]
Note: Samtools' merge does not reconstruct the @RG dictionary in the header. Users
must provide the correct header with -h, or uses Picard which properly maintains
the header dictionary in merging.
3.4 index
必须对bam文件进行默认情况下的排序后，才能进行index。否则会报错。
建立索引后将产生后缀为.bai的文件，用于快速的随机处理。很多情况下需要有bai文件的存在，特别是显示序列比对情况下。比如samtool的tview命令就需要；gbrowse2显示reads的比对图形的时候也需要。1
Usage: samtools index <in.bam> [out.index]
例子：1
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3以下两种命令结果一样
$ samtools index abc.sort.bam
$ samtools index abc.sort.bam abc.sort.bam.bai
3.5 faidx
对fasta文件建立索引,生成的索引文件以.fai后缀结尾。该命令也能依据索引文件快速提取fasta文件中的某一条（子）序列1
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11Usage: samtools faidx <in.bam> [ [...]]
对基因组文件建立索引
$ samtools faidx genome.fasta
生成了索引文件genome.fasta.fai,是一个文本文件，分成了5列。第一列是子序列的名称；
第二列是子序列的长度；个人认为“第三列是序列所在的位置”，因为该数字从上往下逐渐变大，
最后的数字是genome.fasta文件的大小；第4和5列不知是啥意思。于是通过此文件，可以定
位子序列在fasta文件在磁盘上的存放位置，直接快速调出子序列。
由于有索引文件，可以使用以下命令很快从基因组中提取到fasta格式的子序列
$ samtools faidx genome.fasta scffold_10 > scaffold_10.fasta
3.6 tview
tview能直观的显示出reads比对基因组的情况，和基因组浏览器有点类似。1
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12Usage: samtools tview <aln.bam> [ref.fasta]
当给出参考基因组的时候，会在第一排显示参考基因组的序列，否则，第一排全用N表示。
按下 g ，则提示输入要到达基因组的某一个位点。例子“scaffold_10:1000"表示到达第
10号scaffold的第1000个碱基位点处。
使用H(左）J（上）K（下）L（右）移动显示界面。大写字母移动快，小写字母移动慢。
使用空格建向左快速移动（和 L 类似），使用Backspace键向左快速移动（和 H 类似）。
Ctrl+H 向左移动1kb碱基距离； Ctrl+L 向右移动1kb碱基距离
可以用颜色标注比对质量，碱基质量，核苷酸等。30～40的碱基质量或比对质量使用白色表示；
20～30黄色；10～20绿色；0～10蓝色。
使用点号'.'切换显示碱基和点号；使用r切换显示read name等
还有很多其它的使用说明，具体按 ？ 键来查看。
3.7 flagstat
给出BAM文件的比对结果1
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23Usage: samtools flagstat <in.bam>
$ samtools flagstat example.bam
11945742 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
#总共的reads数
0 + 0 duplicates
7536364 + 0 mapped (63.09%:-nan%)
#总体上reads的匹配率
11945742 + 0 paired in sequencing
#有多少reads是属于paired reads
5972871 + 0 read1
#reads1中的reads数
5972871 + 0 read2
#reads2中的reads数
6412042 + 0 properly paired (53.68%:-nan%)
#完美匹配的reads数：比对到同一条参考序列，并且两条reads之间的距离符合设置的阈值
6899708 + 0 with itself and mate mapped
#paired reads中两条都比对到参考序列上的reads数
636656 + 0 singletons (5.33%:-nan%)
#单独一条匹配到参考序列上的reads数，和上一个相加，则是总的匹配上的reads数。
469868 + 0 with mate mapped to a different chr
#paired reads中两条分别比对到两条不同的参考序列的reads数
243047 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
同上一个，只是其中比对质量>=5的reads的数量
3.8 depth
得到每个碱基位点的测序深度,并输出到标准输出。1
Usage: bam2depth [-r reg] [-q baseQthres] [-Q mapQthres] [-b in.bed] <in1.bam> [...]
3.9 其他有用的命令
reheader 替换bam文件的头1
$ samtools reheader <in.header.sam> <in.bam>
cat 连接多个bam文件，适用于非sorted的bam文件1
$ samtools cat [-h header.sam] [-o out.bam] <in1.bam> <in2.bam> [ ... ]
idxstats 统计一个表格，4列，分别为”序列名，序列长度，比对上的reads数，unmapped reads number”。第4列应该是paired reads中有一端能匹配到该scaffold上，而另外一端不匹配到任何scaffolds上的reads数。1
$ samtools idxstats <aln.bam>
3.10 将bam文件转换为fastq文件
有时候，我们需要提取出比对到一段参考序列的reads，进行小范围的分析，以利于debug等。这时需要将bam或sam文件转换为fastq格式。
该网站提供了一个bam转换为fastq的程序：http://www.hudsonalpha.org/gsl/information/software/bam2fastq1
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5$ wget http://www.hudsonalpha.org/gsl/static/software/bam2fastq-1.1.0.tgz
$ tar zxf bam2fastq-1.1.0.tgz
$ cd bam2fastq-1.1.0
$ make
$ ./bam2fastq <in.bam>
3.11 mpileup
samtools还有个非常重要的命令mpileup，以前为pileup。该命令用于生成bcf文件，再使用bcftools进行SNP和Indel的分析。bcftools是samtool中附带的软件，在samtools的安装文件夹中可以找到。
最常用的参数有2： -f 来输入有索引文件的fasta参考序列； -g 输出到bcf格式。用法和最简单的例子如下1
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6Usage: samtools mpileup [-EBug] [-C capQcoef] [-r reg] [-f in.fa] [-l list] [-M capMapQ] [-Q minBaseQ] [-q minMapQ] in.bam [in2.bam [...]]
$ samtools mpileup -f genome.fasta abc.bam > abc.txt
$ samtools mpileup -gSDf genome.fasta abc.bam > abc.bcf
$ samtools mpileup -guSDf genome.fasta abc.bam | \
bcftools view -cvNg - > abc.vcf
mpileup不使用-u或-g参数时，则不生成二进制的bcf文件，而生成一个文本文件(输出到标准输出)。该文本文件统计了参考序列中每个碱基位点的比对情况；该文件每一行代表了参考序列中某一个碱基位点的比对结果。比如：1
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10scaffold_1 2841 A 11 ,,,...,.... BHIGDGIJ?FF
scaffold_1 2842 C 12 ,$,,...,....^I. CFGEGEGGCFF+
scaffold_1 2843 G 11 ,,...,..... FDDDDCD?DD+
scaffold_1 2844 G 11 ,,...,..... FA?AAAA<AA+
scaffold_1 2845 G 11 ,,...,..... F656666166*
scaffold_1 2846 A 11 ,,...,..... (1.1111)11*
scaffold_1 2847 A 11 ,,+9acggtgaag.+9ACGGTGAAT.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG,+9acggtgaag.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG %.+....-..)
scaffold_1 2848 N 11 agGGGgGGGGG !!$!!!!!!!!
scaffold_1 2849 A 11 c$,...,..... !0000000000
scaffold_1 2850 A 10 ,...,..... 353333333
mpileup生成的结果包含6行：参考序列名；位置；参考碱基；比对上的reads数；比对情况；比对上的碱基的质量。其中第5列比较复杂,解释如下：
1 ‘.’代表与参考序列正链匹配。
2 ‘,’代表与参考序列负链匹配。
3 ‘ATCGN’代表在正链上的不匹配。
4 ‘atcgn’代表在负链上的不匹配。
5 ‘*’代表模糊碱基
6 ‘^’代表匹配的碱基是一个read的开始；’^’后面紧跟的ascii码减去33代表比对质量；这两个符号修饰的是后面的碱基，其后紧跟的碱基(.,ATCGatcgNn)代表该read的第一个碱基。
7 ‘$’代表一个read的结束，该符号修饰的是其前面的碱基。
8 正则式’+[0-9]+[ACGTNacgtn]+’代表在该位点后插入的碱基；比如上例中在scaffold_1的2847后插入了9个长度的碱基acggtgaag。表明此处极可能是indel。
9 正则式’-[0-9]+[ACGTNacgtn]+’代表在该位点后缺失的碱基；
pileup具体的参数如下：1
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27输入参数
-6 Assume the quality is in the Illumina 1.3+ encoding. -A Do not skip anomalous read pairs in variant calling.
-B Disable probabilistic realignment for the computation of base alignment quality (BAQ). BAQ is the Phred-scaled probability of a read base being misaligned. Applying this option greatly helps to reduce false SNPs caused by misalignments.
-b FILE List of input BAM files, one file per line [null]
-C INT Coefficient for downgrading mapping quality for reads containing excessive mismatches. Given a read with a phred-scaled probability q of being generated from the mapped position, the new mapping quality is about sqrt((INT-q)/INT)*INT. A zero value disables this functionality; if enabled, the recommended value for BWA is 50. [0]
-d INT At a position, read maximally INT reads per input BAM. [250]
-E Extended BAQ computation. This option helps sensitivity especially for MNPs, but may hurt specificity a little bit.
-f FILE The faidx-indexed reference file in the FASTA format. The file can be optionally compressed by razip. [null]
-l FILE BED or position list file containing a list of regions or sites where pileup or BCF should be generated [null]
-M INT cap mapping quality at INT [60]
-q INT Minimum mapping quality for an alignment to be used [0]
-Q INT Minimum base quality for a base to be considered [13]
-r STR Only generate pileup in region STR [all sites]
输出参数
-D Output per-sample read depth (require -g/-u)
-g Compute genotype likelihoods and output them in the binary call format (BCF).
-S Output per-sample Phred-scaled strand bias P-value (require -g/-u)
-u Similar to -g except that the output is uncompressed BCF, which is preferred for piping.
Options for Genotype Likelihood Computation (for -g or -u):
-e INT Phred-scaled gap extension sequencing error probability. Reducing INT leads to longer indels. [20]
-h INT Coefficient for modeling homopolymer errors. Given an l-long homopolymer run, the sequencing error of an indel of size s is modeled as INT*s/l. [100]
-I Do not perform INDEL calling
-L INT Skip INDEL calling if the average per-sample depth is above INT. [250]
-o INT Phred-scaled gap open sequencing error probability. Reducing INT leads to more indel calls. [40]
-P STR Comma dilimited list of platforms (determined by @RG-PL) from which indel candidates are obtained. It is recommended to collect indel candidates from sequencing technologies that have low indel error rate such as ILLUMINA. [all]
四、 bcftools命令详解
bcftools和samtools类似，用于处理vcf(variant call format)文件和bcf(binary call format)文件。前者为文本文件，后者为其二进制文件。
bcftools使用简单，最主要的命令是view命令，其次还有index和cat等命令。index和cat命令和samtools中类似。此处主讲使用view命令来进行SNP和Indel calling。该命令的使用方法和例子为：
1 | $ bcftools view [-AbFGNQSucgv] [-D seqDict] [-l listLoci] [-s listSample] |
生成的结果文件为vcf格式，有10列，分别是：1 参考序列名；2 varianti所在的left-most位置；3 variant的ID（默认未设置，用’.’表示)；4 参考序列的allele；5 variant的allele(有多个alleles，则用’,’分隔);6 variant/reference QUALity;7 FILTers applied;8 variant的信息，使用分号隔开；9 FORMAT of the genotype fields, separated by colon (optional)； 10 SAMPLE genotypes and per-sample information (optional)。
例如：1
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8scaffold_1 2847 . A AACGGTGAAG 194 . INDEL;DP=11;VDB=0.0401;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,8,3;MQ=35;FQ=-67.5 GT:PL:GQ 1/1:235,33,0:63
scaffold_1 3908 . G A 111 . DP=13;VDB=0.0085;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,5,7;MQ=42;FQ=-63 GT:PL:GQ 1/1:144,36,0:69
scaffold_1 4500 . A G 31.5 . DP=8;VDB=0.0034;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,1,3;MQ=42;FQ=-39 GT:PL:GQ 1/1:64,12,0:21
scaffold_1 4581 . TGGNGG TGG 145 . INDEL;DP=8;VDB=0.0308;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,0,8;MQ=42;FQ=-58.5 GT:PL:GQ 1/1:186,24,0:45
scaffold_1 4644 . G A 195 . DP=21;VDB=0.0198;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,10,10;MQ=42;FQ=-87 GT:PL:GQ 1/1:228,60,0:99
scaffold_1 4827 . NACAAAGA NA 4.42 . INDEL;DP=1;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,1,0;MQ=40;FQ=-37.5 GT:PL:GQ 0/1:40,3,0:3
scaffold_1 4854 . A G 48 . DP=6;VDB=0.0085;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,2,1;MQ=41;FQ=-36 GT:PL:GQ 1/1:80,9,0:16
scaffold_1 5120 . A G 85 . DP=8;VDB=0.0355;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,5,3;MQ=42;FQ=-51 GT:PL:GQ 1/1:118,24,0:45
第8列中显示了对variants的信息描述，比较重要，其中的 Tag 的描述如下：1
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14Tag Format Description
AF1 double Max-likelihood estimate of the site allele frequency (AF) of the first ALT allele
DP int Raw read depth (without quality filtering)
DP4 int[4] # high-quality reference forward bases, ref reverse, alternate for and alt rev bases
FQ int Consensus quality. Positive: sample genotypes different; negative: otherwise
MQ int Root-Mean-Square mapping quality of covering reads
PC2 int[2] Phred probability of AF in group1 samples being larger (,smaller) than in group2
PCHI2 double Posterior weighted chi^2 P-value between group1 and group2 samples
PV4 double[4] P-value for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias
QCHI2 int Phred-scaled PCHI2
RP int # permutations yielding a smaller PCHI2
CLR int Phred log ratio of genotype likelihoods with and without the trio/pair constraint
UGT string Most probable genotype configuration without the trio constraint
CGT string Most probable configuration with the trio constraint
bcftools view 的具体参数如下：
1 | Input/Output Options: |
使用bcftools得到variant calling结果后。需要对结果再次进行过滤。主要依据比对结果中第8列信息。其中的 DP4 一行尤为重要，提供了4个数据：1 比对结果和正链一致的reads数、2 比对结果和负链一致的reads数、3 比对结果在正链的variant上的reads数、4 比对结果在负链的variant上的reads数。可以设定 （value3 + value4）大于某一阈值，才算是variant。比如：1
$ perl -ne 'print $_ if /DP4=(\d+),(\d+),(\d+),(\d+)/ && ($3+$4)>=10 && ($3+$4)/($1+$2+$3+$4)>=0.8' snp_indel.vcf > snp_indel.final.vcf
3.13 samtools rmdup
NGS上机测序前需要进行PCR一步，使一个模板扩增出一簇，从而在上机测序的时候表现出为1个点，即一个reads。若一个模板扩增出了多簇，结果得到了多个reads，这些reads的坐标(coordinates)是相近的。在进行了reads比对后需要将这些由PCR duplicates获得的reads去掉，并只保留最高比对质量的read。使用rmdup命令即可完成.1
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5Usage: samtools rmdup [-sS]
-s 对single-end reads。默认情况下，只对paired-end reads
-S 将Paired-end reads作为single-end reads处理。
$ samtools input.sorted.bam output.bam
五、 SAMtools常用统计命令
SAMtools不仅仅用来call snp。从samtools的软件名就能看出，是对SAM格式文件进行操作的工作，比如讲sam转成bam格式，index，rmdup等等。samtools结合linux命令比如grep，awk和SAM格式描述的flag，tag，亦是非常非常非常强大，比如根据flag过滤duplicate的reads，根据XA tag过滤multiple hit的reads。本文在此只介绍一下samtools的统计命令，能快速对bam文件进行各种统计。
5.1 idxstats
检索和打印与输入文件相对应的index file里的统计信息，所以要对输入的bam文件进行index
1 | $ samtools idxstats in.sam|in.bam|in.cram |
5.2 bedcov
计算覆盖到每个区域的总碱基数目1
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4$ samtools bedcov region.bed in1.sam|in1.bam|in1.cram[...]
#chr start-1 end totalbase
chr1 100000 1000000 1709228
chr2 2000000 65885852 64362582
5.3 depth
计算每个位点的深度1
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4$ samtools depth [options] [in1.sam|in1.bam|in1.cram [in2.sam|in2.bam|in2.cram] [...]]
#chr pos depth
chr1 1 5
chr1 2 5
5.4 flagstat
根据flag统计多少map的reads等信息1
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7$ samtools flagstat in.sam|in.bam|in.cram
43444444 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
5863846 + 0 secondary
0 + 0 supplementary
0 + 0 duplicates
43431948 + 0 mapped (99.97%:-nan%)
37580598 + 0 paired in sequencing
5.5 stats
输出的信息比较多，部分如下1
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13$ samtools stats [options] in.sam|in.bam|in.cram [region...]
Summary Numbers
raw total sequences，filtered sequences, reads mapped, reads mapped and paired,reads properly paired等信息
Fragment Qualitites
根据cycle统计每个位点上的碱基质量分布
Coverage distribution
深度为1，2，3，，，的碱基数目
ACGT content per cycle
ACGT在每个cycle中的比例
Insert sizes
插入长度的统计
Read lengths
read的长度分布
参考内容：